Rođena je u selu Mornese, u pokrajini Aleksandriji (Italija), 9. svibnja 1837. u brojnoj obitelji poljodjelaca. Još kao jaka i zdrava djevojka obrađivala je polje sa svojim ocem koji je znao reći: „Bog nam daje dovoljno kruha kad radimo i molimo.“

Zahvaljujući solidnom kršćanskom odgoju što ga je primila u roditeljskom domu, Marija se, uz nemale žrtve, trudila da svakodnevno pristupi euharistijskom stolu. Znala je reći da bez euharistijskog Isusa ne bi mogla živjeti. Kada se 1860. i u Morneseu pojavio tifus, mjesni župnik don Pestarino zamolio je Mariju da pomogne u liječenju zaraženih u obitelji Mazzarello. Spremno se odazvala pozivu, ali je nažalost pomažući drugima i sama oboljela. Usrdno se molila i Bog je dao da se bolest odjednom povuče, ostavivši je na rubu tjelesne izdržljivosti. Hodajući tako malaksala, imala je viđenje. Pred njom se pojavila velika zgrada s dvorištem punim djevojaka u igri. Jedan glas joj je rekao: „Ove djevojke povjeravam tebi.” Kako se oslabljena nije mogla vratiti poslovima u polju, dogovorila se s prijateljicom Petronilom da se posvete šivanju kako bi, u svoje vrijeme, tom umijeću poučavale siromašne djevojke iz okolnih sela. Gospodin joj je podario pravo majčinsko srce, duha mudrosti i razbora pa je uskoro postala vrlo uspješna odgojiteljica. Otvorila je i malu radionicu za djevojke, kao što je Don Bosco činio za dječake u Torinu. Tako su u stan i u školu počele dolaziti prve siromašne učenice. U pomoć su joj priskočile i neke prijateljice, a skupinu prvih odgajateljica don Pestarino je prozvao „Kćeri Bezgrešne“.

U jesen 1864. Don Bosco je sa svojim dječacima došao u Mornese i otvorio konvikt za dječake iz toga kraja. Kad ga je Marija ugledala, povikala je: „Don Bosco je svetac, ja to osjećam!“ Tom zgodom je posjetio radionicu u Morneseu i ostao zadivljen. Nešto kasnije papa Pio IX. zatražit će od Don Bosca da osnuje žensku družbu, a on će, preko don Pestarina, to djelo započeti sa skupinom prozvanom „Kćeri Bezgrešne“, smjestivši ih u tek osnovani konvikt. Marija i njezine suradnice bijahu siromašne, skromno su se hranile, a nerijetko i oskudijevale. Toj se nevolji pridružilo i poraslo neprijateljstvo mještana. No, među odgojiteljicama i učenicama zavladalo je veliko povjerenje, pouzdanje u Božju providnost i vjera koja je sve više jačala.

Od prvih petnaest djevojaka iz udruženja „Kćeri Bezgrešne“ osnovao je Don Bosco 1872. družbu „Kćeri Marije Pomoćnice“. Za vrhovnu poglavaricu izabrana je Marija Mazzarello, premda se ona prozvala „zamjenicom“, tvrdeći da je njihova prava poglavarica Marija Pomoćnica. Družba je brzo rasla, otvorene su prve ustanove pa je prva skupina misionarki uskoro pošla u Ameriku. Marija je bila brižna, jednostavna i puna ljubavi prema svima, zbog čega su je prozvali „majkom“. Bila je susretljiva, ponizna i obavljala najjednostavnije poslove. Mudro je vodila družbu trudeći se da u njoj zavlada istinska duhovnost i da se u sestrama nastani Don Boscova karizma. Umrla je u Nizzi Monferatto 14. svibnja 1881. u 44. godini života. Družba je u to vrijeme imala 165 sestara u 28 kuća (19 u Italiji, 3 u Francuskoj i 6 u Americi). U novicijatu je bilo 65 novakinja. Papa Pio XI. proglasio ju je blaženom 20. studenoga 1938, a Pio XII. svečano ju je kanonizirao 24. lipnja 1951. Njezin spomendan slavi se 13. svibnja.